Les méthodes biophysiques d'étude de la cellule » maladies des plantes , agriculture et écologie

 Les méthodes biophysiques d'étude de la cellule

21/7/2008

Les méthodes biophysiques d’étude de la cellule :

Fractionnement cellulaire

 

            I- Définition

Ce sont des méthodes qui permettent de séparer le tissu en ses types cellulaires ,la cellule en ses organites et macromolécules fonctionnels (acides nucléiques)  protéines).Elles entraînent d’une manière douce la lyse(rupture ou éclatement)des membranes(plasmiques et du RE) de  manière douce  pour libérer les organites intracellulaires ( conservés en bon état) dans le milieu ambiant tout en conservant aussi leurs propriétés morphologiques, physiologiques et biochimiques .Ces méthodes permettent ainsi d’obtenir les différentes parties constitutives de la cellules en factions purifiées pour déterminer leurs :

¨      - composition biochimique

¨      - fonctions

 

            II- Techniques

                1 :Homogénéisation

La dissociation des cellules des tissus et la rupture des membranes cellulaires peuvent se faire en utilisant plusieurs procédés :

¨      - forcer le passage des cellules à travers des petits orifices d’une grille en acier très fine pour entraîner leur dilacération .

¨      - soumettre les cellules à un choc osmotique

¨      - exposer les cellules à des vibrations ultrasoniques

¨      - broyer les tissus à l’aide d’un mixer ou d’un appareil :Potter :homogénéisation ;il se présente sous la forme d’un tube muni d’un piston dont la vitesse de rotation qui entraîne la rupture des membranes cellulaires .Les cellules sont d’abord mises en suspension dans une solution contenant des ions minéraux et organiques (saccharose) à une concentration définie  pour préserver l’état des fractions cellulaires(structures et fonctions).Après le broyage ,la suspension cellulaire est réduite à une épaisse suspension de particules (homogénat ou extrait)qui ont chacune une taille ,une charge et une densité.

 

            2 : Centrifugation   

C’est à partir de cet homogénat qu’on peut séparer les différents constituants cellulaires par fractionnement ou sédimentation :qui consiste à laisser reposer l’homogénat pendant un certain temps ;les particules vont se déposer au fond du tube selon à des temps différents (différentes vitesses de sédimentations ).La vitesse de sédimentation est d’une structure dépend de sa taille ,sa densité et sa forme :

Par exemple :les noyaux se déposent les premiers(plus lourds) et les ribosomes les derniers (plus légers).

La sédimentation est  accélérée par l’utilisation des appareils utilisant des forces centrifuges :centrifugeuses (réfrigérée pour lutter contre l’échauffement dû au frottement sur l’air des pots ou du rotor métallique au cours de la centrifugation) ou ultracentrifugeuses (plus puissante et établissement du vide très poussé afin d’éviter l’échauffement du rotor par frottement d l’air).   .L’action d’accélération de la sédimentation par ces appareils est appelée centrifugation ou ultracentrifugation .

 

            Description d’une centrifugeuse :

- un bloc métallique contenant des orifices pour l’introduction des tubes( une gamme ) qui contiennent les échantillons.

- un rotor

- un axe de rotation qui est responsable de la centrifugation dont la vitesse est donnée par nb tours/mn ou g.

- une minuterie qui permet de contrôler le temps .

     

            2-1 : Centrifugation différentielle

C’est une méthode de séparation qui permet l’isolement des organites cellulaires  selon leurs densité et leur taille (des composés de taille différente ) :

¨      - L’extrait cellulaire est centrifugé à des vitesses relativement basses (60g pendant 10mn) :les noyaux (plus lourds )subissent la plus grande force centrifuge et migrent le plus rapidement en formant un sédiment (culot) au fond du tube. 

¨    - Le surnageant (homogénat restant)  est centrifugé de nouveau à une vitesse légèrement supérieure  (10.000g pendant 5mn),un culot de mitochondries se dépose .

¨      - Le surnageant est centrifugé de nouveau à une vitesse plus élevée (100000 pendant 60mn),ce sont les petites vésicules : microsomes (de RE)  qui sédimentent.

¨      - Le surnageant est de nouveau centrifugé  (100000 pendant 130mn) ,dans ce cas ce sont les ribosomes qui sédimentent en dernier. Le surnageant obtenu après le culot des ribosomes est appelé fraction soluble (enzymes ,acides aminés ,sucres…)           

 

            2-2 :Centrifugation en gradient de densité   

La centrifugation différentielle ne permet pas de séparer tous les organites ;les mitochondrie et les lysosomes sont souvent mélangés et ne peuvent être séparés .Une autre méthode de centrifugation par gradient de densité peut les séparer. Dans ce cas le broyât cellulaire est déposé à la surface (couche fine) du tube de centrifugation qui contient un liquide possédant un gradient de densité obtenu avec des sels ou du saccharose (continu ou discontinu).La sédimentation des particules se fait en fonction de leur  densité et se séparent beaucoup mieux les unes des autres (cas des mitochondries et lysosomes). La sédimentation se fait à des vitesses différentes formant des bandes dans les solutions salines.

             

            2-2-1 : de zones

Elle sépare les molécules selon leur degré de sédimentation .Elle consiste à déposer une solution contenant  les particules à séparer sur une colonne liquide  constituant un gradient de densité .Sous l’effet de la force centrifuge ,les particules d’une même espèce ayant la même vitesse de sédimentation se regroupe en zones.

          

            2-2-2 : isopycnique

Elle consiste à utiliser un gradient de densité recouvrant les densités des différents particules .Au bout d’un certain temps de centrifugation ,celles se ressemblent à un point ou leur densité est égale à celle du milieu .

 

 

 

 

 

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