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 Les techniques de chromatographie

21/7/2008

                                          Les techniques de chromatographie

            I : Définition

Ce sont des techniques qui permettent de séparer les petites molécules(oses, acides aminés) , les molécules à un poids élevé ,les hormones et les lipides et le fractionnement des protéines en acides aminés .

Son principe repose sur le fait que les différents constituants d'un mélange présentent des affinités variables pour un support(particules et microcanicules ) et sont adsorbés plus ou moins rapidement sur ce dernier au fur et à mesure de la progression d'un solvant sur e support (solvant sert à entraîner le mélange).Des interactions physiques s'établissent entre le support et les molécules à séparer (réactions de fixation rapides ),leur force dépend de la nature chimique des molécules à séparer .On fait passer à travers le support une solution ,on entraîne certaines molécules plus vite que d'autres ,ce qui permet leur séparation.

 

            II :Différentes  techniques de chromatographie

          II-1 : Chromatographie de partage

Elle utilise un support qui retient un premier solvant (eau).Il est traversé  par un second solvant non miscible au premier (toluène, alcool).Les substances à séparer vont se partager entre les 2 solvants ;celles qui sont plus solubles dans  le toluène que dans l'eau sont entraînées les premières.  

  

            Chromatographie sur couche mince 

 

            A : Définition

C'est une technique de séparation des molécules en utilisant un support tel que le papier filtre (absorbant) ou une plaque de verre ou  de plastique recouverte d'une poudre fine (silicagel, cellulose, gel …).Elle permet de séparer les acides biliaires,composés lipidiques ( triglycérides, phospholipides, stérols…)

 

            B :Technique

¨      Dépôt d'une goutte (5 à 10µl) de l'échantillon sur le support à

¨      5cm au dessus du bord de la partie inférieure du support (plaque ou papier) :chromatographie ascendante.

¨      5cm au dessous du bord de la partie supérieure du support :chromatographie descendante 

¨      Imprégnation du support dans un mélange de 2 solvants en maintenant le support verticalement (  mmergé sur 1 cm de sa hauteur dans le solvant pour qu'il diffuse pendant la durée de la chromatographie)  dans une enceinte fermée (cuve) contenant le solvant ( phase mobile) qui monte ou descend (selon le type de chromatographie) dans le support par capillarité. Le passage de l 'échantillon  au niveau du solvant réalise un partage des substances entre l'eau qui imprègne le support et la phase mobile.

Les différents composants de l 'échantillon migrent (développement du chromatogramme) à des vitesses dans le support selon leur solubilité relative dans le solvant ( adsorbé de façon préférentielle par les fibres (papier) ou la poudre (plaque).

¨      Développement et séchage

¨      Révélation des différentes molécules qui ont été séparées en pulvérisant la surface du chromatogramme avec un réactif convenable qui fait apparaître les substances cherchées sous forme de tâches colorées.

 

             2 :Chromatographie sur colonne

             2-1 : Définition

C'est une méthode de séparation des molécules sur un support contenu dans un cylindre  de verre  ou      d'acier dont la partie inférieure est munie d'un filtre qui empêche la poudre du support de s'échapper. Cette colonne contient une matrice poreuse ;suivant le choix de cette matrice , les molécules peuvent être séparées selon leur capacité à  se  fixer à des groupements chimiques particuliers :chromatographie d'affinité. 

 

             2-2 : Chromatographie d'affinité

             2-2-1 : Définition

C'est une technique de séparation des molécules selon leur affinité avec des groupements chimiques particuliers en se fixant à eux  avec des liaisons covalentes .C'est un phénomène de reconnaissance  spécifique de molécules entre elles et leur fixation l'une à l'autre avec une grande affinité :

-enzyme- substrat ,antigène anticorps , hormone sur son  support récepteur ,fixation de certaines cellules sur des macromolécules extra cellulaires, protéines plasmiques ,albumine ,acides nucléiques.

 

            2-2-2 Technique

On fait passer à travers la colonne contenant une matrice(bille de polysaccharide, d'agarose ,perles de polyacrylamide ) une solution de l'échantillon (enzyme ,antigène, molécule…) qui se fixe sur le substrat (matrice) .On  procède à des lavages avec un tampon approprié pour récupérer les molécules fixées pures dans le tampon.    

 

            2-3-Chromatographie liquide à haute performance

            2-3-1 Définition

C'est une technique de séparation plus fine et précise  des molécules sur colonne ( résines ) enphase liquide  sous une haute pression àlélution (30 bars) assurant un pouvoir de résolution très élevé et très rapide avec une excellente reproductibilité.

           

            2-3-2 Technique

    L'échantillon est introduit dans une colonne en acier (5 à 25 cm) contenant une matrice avec des résines (sphères minuscules de 3 à 10 µm de diamètre ) avec une seringue.

     Les solutés s'équilibrent très  rapidement (1h30 à 2h ) avec  l'intérieur des  sphères minuscules de sorte que les solutés d'affinités différentes pour la matrice sont séparées efficacement les uns des autres même à des vitesses d'écoulement importantes ce qui permet le fractionnement en quelques minutes.

 

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